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       ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）加樣是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，它包含了加樣本、加檢測(cè)抗體、加底物、加終止液等步驟。操作不當(dāng)可能導(dǎo)致結(jié)果偏差，因此要注意以下事項(xiàng)：

1）實(shí)驗(yàn)室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA較為敏感，每孔加入液體量誤差會(huì)導(dǎo)致最后讀數(shù)差別，因此避免儀器帶來(lái)誤差。

2）加樣前，溶液充分混勻，加樣時(shí)不可90°向孔中滴加液體，否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法：45°吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

3）加樣時(shí)速度不可過(guò)快，否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。

4）加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出應(yīng)用吸水紙輕輕拭干并作相應(yīng)記錄。

5）每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。

通過(guò)規(guī)范操作和細(xì)節(jié)控制，可顯著提高ELISA結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。若發(fā)生邊緣效應(yīng)（周邊孔顯色異常），建議使用封板膜密封，避免蒸發(fā)不均。

       在ELISA實(shí)驗(yàn)中，“花板”通常是指酶標(biāo)板孔內(nèi)出現(xiàn)的顏色不均勻、邊緣與中心顏色差異大、斑駁或斑點(diǎn)狀顯色的現(xiàn)象，從而干擾吸光度（OD值）的測(cè)定，導(dǎo)致數(shù)據(jù)重復(fù)性差，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。一旦出現(xiàn)“花板”，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須放棄，不僅浪費(fèi)物料和時(shí)間，而且還會(huì)出現(xiàn)樣本量缺少、交叉污染、報(bào)告延遲等一系列問(wèn)題。

    上海軒澤康生物技術(shù)解析：通過(guò)系統(tǒng)排查原因并優(yōu)化步驟，“花板”的主要原因有：1）包被或封閉不充分。2）洗滌不徹底。3）酶標(biāo)二抗或底物問(wèn)題。4）操作不當(dāng)。5）樣本或試劑污染。嚴(yán)格控制洗滌流程、控制環(huán)境因素（避免高溫、強(qiáng)光，顯色階段避光）、加樣時(shí)槍頭避免觸碰孔壁；孵育時(shí)覆蓋封板膜等均可有效減少花板現(xiàn)象，提高ELISA結(jié)果的可靠性。

       做ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果總是不滿(mǎn)意？看看是不是這幾個(gè)點(diǎn)沒(méi)注意到....

Q1：為什么所有試劑和檢測(cè)樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作？

上海軒澤康生物技術(shù)解析：溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫。包括檢測(cè)樣本，避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

Q2：ELISA實(shí)驗(yàn)為什么必須設(shè)置復(fù)孔？

上海軒澤康生物技術(shù)解析：復(fù)孔檢測(cè)可以計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確；同時(shí)還能解決實(shí)驗(yàn)中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象；計(jì)算CV值，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評(píng)估。

Q3：為什么實(shí)驗(yàn)過(guò)程中孵育洗滌需要振蕩？如何振蕩？

上海軒澤康生物技術(shù)解析：孵育過(guò)程振蕩可以加快、加強(qiáng)抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過(guò)程更加完全。OD值通常會(huì)比未振蕩孵育的結(jié)果要高。洗滌過(guò)程振蕩可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值。同時(shí)可以提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度。

        ELISA檢測(cè)原理：向預(yù)先包被有目標(biāo)物檢測(cè)因子捕獲抗體的微孔中，加入待檢測(cè)的樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體、HRP酶結(jié)合物，經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在酶的作用下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺與樣本中目標(biāo)檢測(cè)因子呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450nm下測(cè)定吸光度，即可根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣品中目標(biāo)檢測(cè)因子的濃度。