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穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株）構(gòu)建指通過基因工程手段，將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，構(gòu)建能夠長期穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá)的細(xì)胞株。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株能彌補瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)時間短的缺陷，廣泛用于基因功能研究、藥物篩選、重組蛋白和單克隆抗體生產(chǎn)等應(yīng)用。
1、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒：將目的基因（需過表達(dá)或敲低的基因）插入慢病毒表達(dá)載體中，并確保慢病毒載體包含抗性標(biāo)記和用于追蹤的報告基因。
2、預(yù)實驗：通過殺滅曲線實驗確定確定用于篩選的抗生素對特定細(xì)胞系的最低完全致死濃度，通過梯度實驗摸索確定最佳MOI（感染復(fù)數(shù)，即每個細(xì)胞感染的病毒顆粒數(shù)）。
3、病毒包裝：將重組慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒（如psPAX2）和包膜質(zhì)粒（如pMD2.G）共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞（如293T)中。轉(zhuǎn)染后48-72小時收集含有慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，必要時進(jìn)行濃縮和滴度測定。
4、抗生素篩選：根據(jù)預(yù)實驗確定的最佳MOI值，將慢病毒液加入到目標(biāo)細(xì)胞中。
感染一定時間（通常是48-72小時）后，加入確定濃度的抗生素進(jìn)行篩選。未成功整合病毒載體的細(xì)胞會全部死亡，而成功整合的細(xì)胞由于表達(dá)了抗性基因，能夠存活并增殖。
5、多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選和鑒定：存活下來的細(xì)胞群體是混合克隆，可初步用于實驗，但其特性可能不均一。為獲得性狀均一、穩(wěn)定的細(xì)胞株，常需進(jìn)行單克隆篩選（有限稀釋法或者流式細(xì)胞分選）。
6、驗證與保種：在mRNA水平（如qRT-PCR）和蛋白水平（如Western Blot）檢測目的基因的表達(dá)情況，根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行相應(yīng)的功能學(xué)實驗，驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否達(dá)到預(yù)期效果。對驗證合格的細(xì)胞株進(jìn)行大量擴(kuò)增并凍存保種。定期用抗生素維持壓力，防止基因沉默或丟失。
1、提交實驗報告書（耐藥指數(shù)、實驗試劑與設(shè)備、實驗過程、結(jié)果分析、原始數(shù)據(jù)、細(xì)胞圖片等）。
2、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
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