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細胞成球實驗（sphere-formation assay）又稱球囊懸浮實驗，讓單細胞在非貼壁依賴培養(yǎng)條件中培養(yǎng)，大部分細胞因缺乏貼壁條件而凋亡，而部分具有干性的細胞能夠聚集成團形成三維球體結構，且能在體外進行多次傳代。通過細胞成球實驗可以評估細胞的自我更新能力，模擬體內三維微環(huán)境，研究細胞增殖、分化和藥物反應。
（一）一次成球
1、單細胞懸液制備：對數(shù)生長期細胞胰酶消化后離心，PBS清洗2次，用干細胞培養(yǎng)基輕輕吹打重懸細胞并計數(shù)。
（干細胞培養(yǎng)基：DMEM/F12或1640培養(yǎng)基，含有1×B27營養(yǎng)液、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和5μg/ml胰島素）
2、細胞鋪板：選擇超低吸附細胞培養(yǎng)六孔板，每孔1000個細胞（500-5000個，取決于細胞的成球能力），補加3ml培養(yǎng)基。
3、細胞球培養(yǎng):5%CO2 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，每隔2-3天半量換液。顯微鏡下觀察細胞成球情況和形態(tài)。
（二）二次成球
1、收集細胞球：收集一次成球得到的細胞球，離心去上清，胰酶消化，終止消化，離心去上清，PBS清洗2次，干細胞培養(yǎng)基輕輕吹打重懸細胞并計數(shù)。
2、細胞鋪板：選擇超低吸附細胞培養(yǎng)六孔板，每孔1000個細胞（500-5000個，取決于細胞的成球能力），補加3ml培養(yǎng)基。注意鋪板的細胞數(shù)量應與一次成球鋪板的細胞數(shù)量相同；
3、細胞球培養(yǎng):5%CO2 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，每隔2-3天半量換液。顯微鏡下觀察細胞成球情況和形態(tài)。
（三）結果處理與分析
在細胞成球達到理想狀態(tài)后，可以進行各種實驗處理和分析。
1、可以添加藥物或生物活性物質，觀察對成球形態(tài)和細胞功能的影響；
2、可以進行基因表達分析，研究成球中特定基因的表達水平變化;
3、可以進行細胞增殖、分化或凋亡等功能實驗。
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