RRBS甲基化測(cè)序
Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，通過酶切富集啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域，并進(jìn)行Bisulfite測(cè)序，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)的高分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點(diǎn)，與基因表達(dá)、表型性狀息息相關(guān)。RRBS作為一種高性價(jià)比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。利用RRBS可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣本的比對(duì)基因組分析。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1. 直接針對(duì)酶切富集啟動(dòng)子區(qū)域以及CpG島區(qū)域進(jìn)行甲基化研究。
2. DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)的高分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率，有效增加了測(cè)序深度。
3. 可以與單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞RRBS測(cè)序。
技術(shù)線路：
樣本準(zhǔn)備：
（1）樣品總量：≥ 3 μg DNA（常規(guī)樣本），≥ 5 μg DNA（FFPE或降解DNA樣本）；
（2）樣品純度：OD260/280 = 1.8-2.0；
（3）樣品完整性：DNA無(wú)明顯降解與蛋白污染，需提供凝膠電泳檢測(cè)膠圖。
數(shù)據(jù)分析：
應(yīng)用案例：
研究背景：
1.DNA甲基化發(fā)育和疾病中起著重要的作用。脊椎動(dòng)物的DNA甲基化主要位點(diǎn)是在CpG二核苷酸的胞嘧啶背景下，此類型大約占人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞的總甲基化含量四分之三。盡管我們對(duì)CpG甲基化的基因組分布、個(gè)體間的穩(wěn)定性、功能作用有深入的研究，但是對(duì)CPA，CPT和CPC（非CpG島）二核苷酸的DNA甲基化方面知之甚少。
2.利用RRBS測(cè)序，我們對(duì)人類多功能細(xì)胞和分化細(xì)胞的非CpG甲基化與76個(gè)基因組庫(kù)的DNA甲基化圖譜進(jìn)行深入分析，確認(rèn)了非CpG甲基化主要存在多能干細(xì)胞類型，與DNMT3表達(dá)水平存在很強(qiáng)的相關(guān)性，并且可能與CpG甲基化存在空間上的相關(guān)性。通過大規(guī)模代表性樣本的研究，有助于我們進(jìn)一步了解人類細(xì)胞中的胞嘧啶甲基化模式。
研究方法：
1. 提取20種人類胚胎干細(xì)胞株、12種人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞、10種不同人類體細(xì)胞DNA。
2. RRBS測(cè)序檢測(cè)非甲基化。
3. 生物信息學(xué)分析。
分析結(jié)果：
1. 人類不同細(xì)胞類型的CpG甲基化和分布情況。在40-260bp區(qū)域內(nèi)，檢測(cè)到3.4million CpG 二核苷酸和11.5million非CpG二核苷酸，與之前公布的hESC（human embryonic stem cells）株H1的WGBS數(shù)據(jù)庫(kù)比較，兩者重疊的CpG甲基化區(qū)域占很大部分，且非CpG甲基化程度都比較低。
2. 敲除DNMT3A基因，導(dǎo)致人類胚胎干細(xì)胞全面減少非CpG甲基化水平,而且CpA甲基化動(dòng)態(tài)水平變化與DNMT3基因表達(dá)水平密切相關(guān)，降低CpA甲基化程度，同時(shí)會(huì)伴隨著DNMT3A和DNMT3B基因表達(dá)水平下降。
